自2019年12月SARS-CoV-2引起的COVID-19爆发以来，已对中国乃至全球构成重大的的公共卫生威胁。截至3月15日，全球40多个国家/累计确诊人数超过15万，死亡人数近6千人，目前尚无好转迹象。动物模型对于阐明病毒感染与发病机制、传播途径以及抗病毒药物和疫苗评价至关重要。2020年3月9日，Nature发表新闻，实验室竞相开展SARS-CoV-2的动物模型研究，曾为SARS-CoV研发的转基因小鼠供不应求【1】。此前中国医学科学院实验动物研究所秦川团队研制的动物模型已于2月18日通过科技部组织的鉴定，率先建立了COVID-19的转基因小鼠模型和恒河猴模型【2】。转基因小鼠模型的研究经过两次修改，已于2月28日将该第三版本的论文上传至预印版bioRxiv，该研究阐明了hACE2小鼠中SARS-CoV-2感染的致病性，促进了抗病毒药物治疗研究和疫苗开发【3】。
2020年3月14日，中国医学科学院实验动物研究所、北京协和医学院秦川团队在预印版bioRxiv上同时发表了两篇研究论文：“Reinfection could not occur in SARS-CoV-2 infected rhesus macaques”和“Rhesus macaques can be effectively infected with SARS-CoV-2 via ocular conjunctival route”，建立了恒河猴的SARS-CoV-2感染模型，阐述了恒河猴的COVID-19特征，确定了SARS-CoV-2的气道感染和结膜感染途径以及康复后不会发生再次感染现象。值得注意的是，秦川团队此前曾于2005年和2014年先后建立SARS-CoV感染和MERS-CoV感染的恒河猴模型【4-5】。
研究者对4只恒河猴气道接种半致死剂量的SARS-CoV-2，对体重、体温、X光、血清学和各种拭子样本进行检测，发现有3只猴子感染后7天体重略微减轻，所有猴子均未观测到直肠温度变化，临床数据表明在接种病毒后出现暂时性食欲下降、呼吸率提高和弓身现象。鼻拭子和咽拭子在感染后3天病毒载量最高，随后开始下降。同样地，肛拭子病毒载量第3天最高，第14天下降到检测限以下。
图1.恒河猴SARS-CoV-2感染模型的实验设计和样品收集为了识别SARS-CoV-2在猴子体内的分布以及组织病理学变化，在感染后第七天，对其中1只猴子实施安乐死并解剖，发现病毒广泛分布在鼻、咽、肺、肠道、脊髓、心脏、骨骼肌肉和膀胱组织内。此外，通过HE染色和抗SARS-CoV-2的S蛋白抗体染色，确认病变主要发生在肺部，呈现间质性肺炎症状，特征是肺泡隔膜变厚、肺泡巨噬细胞积累、肺泡上皮退化和炎症细胞渗透。继续跟踪其余3只猴子，发现与感染后第3天和第7天相比，抗SARS-CoV-2的特异性抗体在第14、21和28天水平显著升高。事实上，中国科学院武汉病毒研究所单超/袁志明/石正丽团队不久前在预印版Research Square发表的研究已经发现了恒河猴在感染SARS-CoV-2后病情相当轻微，体重稍有减轻，无发烧现象，但肺部X射线检查显示出类似人类COVID-19的肺炎症状。
图2. SARS-CoV-2感染的恒河猴临床特征、病毒复制和免疫反应
此前有报道SARS-CoV-2感染的出院病人在康复后检测再次呈阳性，但目前还不清楚康复患者是否有"复发"或"再感染"的风险。于是研究者在其余的猴子康复后进行再次感染以评估风险，再感染前的3只猴子符合临床出院标准，即无临床症状和放射异常，两次RT-PCR检测阴性。将其中的两只猴子以相同的半致死剂量进行SARS-CoV-2再感染后，体重未发生变化，体温有短暂性增加，在鼻拭子、咽拭子和肛门拭子中均检测不到病毒载量。再感染5天后，将其中一只猴子安乐死并解剖，发现所有组织中均没有病毒复制，肺组织也无任何病理损伤和病毒抗原。未安乐死的另一只猴子胸部X光显示没有异常。以上结果表明，在感染SARS-CoV-2的猴子康复后不会再感染相同的毒株，且恢复后的猴子也没有出现复发情况。血清学证据也显示在随后受感染的猴子中没有发现抗体依赖增强（ADE）作用。基于以上结果，研究者评估认为在初次感染的早期阶段，猴子体内已产生中和性抗体足够抵御SARS-CoV-2，另一方面，在再感染的猴子的所有组织均检测不到病毒复制，意味着SARS-CoV-2在体内可能不会存留很长时间，所以“复发”或“再感染”的病人可能是由于检测的“假阴性”造成的。综合结果表明，初次感染SARS-CoV-2康复后产生抗体可以预防再次感染，这对疾病预后和疫苗设计具有重要作用。
图3. SARS-CoV-2感染的恒河猴病理切片和胸部X光的跟踪检测
基于SARS-CoV-2潜在的人结膜感染途径，研究者利用以上恒河猴模型对SARS-CoV-2的结膜感染途径进行研究，对3只恒河猴进行半致死剂量的SARS-CoV-2感染，其中2只选择结膜感染，另1只通过气道感染作为对照。在感染后的1、3、5和7天收集拭子样本，通过不同感染途径比较宿主中病毒的分布情况以及发病机制，对临床症状、病毒载量和血清反应进行检测。结果显示，所有猴子的体重和体温都没有发生变化，鼻拭子和咽拭子在感染后的1到7天均可以检测到病毒。但结膜途径感染的猴子在结膜拭子中仅在感染后第1天可以检测到，这意味着SARS-CoV-2可能从结膜转移到呼吸道和其他组织中。其中1只结膜感染的猴子和气道感染的猴子在感染7天后实施安乐死并解剖，发现结膜途径感染的猴子病毒广泛分布在鼻腔系统、眼部、咽部、口腔、腹股沟和直肠周围的淋巴结、肺、胃、盲肠、小肠以及十二指肠等各个组织中。相比之下，气道途径感染的猴子病毒主要集中在肺部，病毒载量最高。此外鼻黏膜、气管、下颌淋巴结、扁桃体、肺淋巴结和一些消化器官如结肠、盲肠等也均有分布。值得注意的是，病毒在消化道的不同部分均可以被检测出来，意味着消化系统可能容易受到SARS-CoV-2的攻击。此外在结膜途径感染后的14天和21天，可以检测到抗SARS-CoV-2的特异性IgG抗体。以上结果表明，猴子可以通过结膜途径感染SARS-CoV-2。相比之下，结膜感染的猴子在鼻咽系统中病毒载量和分布相对较高。与通过气道接种的猴子相比，肺部感染相对温和且不集中。这两条途径都可能导致感染消化道。
图4.SARS-CoV-2气道/结膜途径感染的恒河猴的临床特征、病毒分布和血清抗体检测
结膜途径感染的猴子在鼻咽系统相关组织中病毒载量高，尤其是结膜、泪腺、鼻腔和咽部，这些组织是眼部到呼吸道组织的通道，特别是泪管作为管道将泪液从眼表面运输到下鼻道进入呼吸道组织。此前的研究也证明了虽然带有病毒的液体可以通过结膜等被吸收，但大多数液体如泪液和分泌物被排入鼻咽或吞咽，下鼻道也有助于吸收泪液。目前人们主要通过佩戴口罩防止SARS-CoV-2从鼻腔和口腔进入，结膜途径往往被忽视，具有潜在的传播风险，尤其是与患者密切接触者如临床医生，除了勤洗手和穿防护服以外，更应提高对眼部的保护意识。
原文地址：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.13.990226v1https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.13.990036v1
